Дисертаційна робота присвячена дослідженню особливостей металдепонувальних властивостей та антиоксидантного потенціалу металотіонеїнів двостулкового молюска Unio tumidus за субхронічного та короткотривалого впливу ксенобіотиків з метал-хелатуючими властивостями. У сучасному складі забруднювачів водного середовища приорітетними визнаються «мікроорганічні забруднювачі», до яких належать речовини побутового та сільськогосподарського походження, зокрема фармацевтичні препарати, засоби особистого вжитку, відходи сільського господарства. Їх біологічна небезпека у водоймах ускладнюється непрогнозованою поведінкою їх поєднання, особливо, за кліматичних змін. Відтак, прогноз реальних загроз для біоти комбінованого забруднення водойм повинен грунтуватися на застосуванні адекватних експериментальних схем та чутливих і специфічних молекулярних мішеней, критично задіяних у біологічній активності ксенобіотиків. Двостулкові молюски є визнаними біоіндикаторами стану водойм, завдяки фільтруючому способу харчування та осілому способу існування. Проте дослідження впливу на них токсикантів водного середовища зосереджено переважно на експериментах з використаннях окремих ксенобіотиків у високих концентраціях. З’являється дедалі більше аргументів щодо залучення есенціальних металів, зокрема цинку, у реакції стресу та детоксикації. Метаболізм та розподіл цинку у клітинах забезпечується функціонуванням цинкдепонувальних протеїнів та метал-транспортних систем. Металотіонеїни (МТ) – це універсальні у тваринному світі метал-депонувальні протеїни, до складу яких входить близько 30% цистеїну. Традиційно МТ вважають біомаркерами забруднення токсичними металами. Разом з тим, ці індуцибельні тіоли володіють антиоксидантним потенціалом. Гербіцид Раундап (комерційна форма гліфосату) та фармацевтичні препарати ніфедипіну, диклофенаку, хлорпромазину є одними із найпоширеніших забруднювачів водойм. Важливо, що кожен з них, окрім специфічних цільових ефектів, здатний впливати на гомеостаз металів безпосередньо у організмах чи довкіллі, хелатуючи їх та/або регулюючи металтранспортні канали. Тому у дисертаційному дослідженні ми використали ці модельні ксенобіотики для з’ясування особливостей фунціонування МТ у наближених до екологічно реальних умов існування двостулкового молюска U. tumidus . Для цього молюсків впродовж 14 днів піддавали впливу диклофенаку (Dc, 600 нг/л), ніфедипіну (Nf, 700 нг/л), Раундапу (Rn, 33,8 мкг/л, що відповідає ~80 нМ гліфосату) окремо при 18 °С та спільно при 18 °C (Mix) та 25 °C (МіxТ), а також Раундапу (Rn, 16,9 мкг/л, що відповідає ~40 нМ гліфосату) при температурах 18 °C та при 25°C (RnT), хлорпромазину (Cpz, 18,0 мкг/л) та суміші Раундапу і хлорпромазину при 18 °C (RnCpz). Концентрації ксенобіотиків відповідали їх вмісту у прісних водоймах та, для Раундапу, 0,5 та 1,0 розрахованої концентрації, яка не дає ефекту (PNEC). Температурний режим 25 °C відповідав встановленим показникам для басейну р. Дністер у літній час. Для з’ясування механізму впливу Раундапу на гомеостаз цинку порівнювали його дію з впливом хелатора цинку N,N,N?,N?-тетракіс(2- піридилметил)етилендіаміну (ТПЕНу) у моделі ex vivo, у якій зразки травної залози перлівниці піддавали дії Раундапу, ZnCl2, ТПЕНу та їх комбінацій ZnTПЕН або ZnRn у концентрації 3 мкМ. Згідно аналізу спектру в ультрафіолетовій ділянці (УФ-спектр) та вмісту металів у складі елюату визначено, що необхідною умовою для виділення МТ методом гель-розподільної хроматографії та забезпечення оптимального вмісту цинку є відсутність консерванту азиду натрію у гелі та використання тіолозахисного агента меркаптоетанолу. Вплив 40 та 80 нМ Раундапу та фармацевтичних препаратів диклофенаку, ніфедипіну та хлорпромазину на організм U. tumidus протягом 14 діб поокремо та у суміші за двох температурних режимів продемонстрував, що 80 нМ Раундапу (особливо, на 43 %), а також диклофенак, ніфедипін та суміш цих ксенобіотиків при тепловій дії викликають зростання вмісту MT-SH на 26- 57,8% порівняно з контролем та дисбаланс вмісту MT-SH/MT-Me, що свідчить про збільшення антиоксидантного потенціалу МТ та одночасне зниження їх здатності зв’язувати метали. Змінюється і співвідношення металів у складі МТ із зростанням частки купруму та/або кадмію. У всіх групах молюсків за впливу 80 нМ Раундапу, окремо, або у комбінації, зростає вміст недепонованих у МТ купруму та кадмію у тканині та зменшується співвідношення Zn/Cu. Диклофенак викликав зростання вмісту недепонованого цинку, який, проте, нівелювався за комплексного впливу. Відтак, за впливу на організм 80 нМ Раундапу окремо та у поєднанні з фармацевтичними препаратами, особливо за підвищеної температури, проявляється домінуюча дія Раундапу як дестабілізатора вмісту та співвідношення цинку у клітинах травної залози молюска. Дослідження впливу на організм 40 нМ Раундапу окремо та у комбінації з хлорпромазином або за підвищеної температури виявило зростання концентрації MT-SH відповідно на 33,6 - 57,7 %, тоді як хлорпромазин не змінював його. Разом з тим, рівень цинку у МТ зростав у всіх дослідних групах, найбільше за впливу Раундапу при підвищеній температурі та хлорпромазину, а вміст цинку в тканині суттєво зменшився (на 15,9 та 24,6% відповідно). Відтак, дослідження вмісту МТ та балансу його метальованої форми стосовно загального вмісту МТ та вмісту цинку у тканині виявило залежні від природи та концентрації (для Раундапу) ксенобіотика зміни цих показників. Оцінка антиоксидантного потенціалу МТ показала, що дія на організм 80 нМ Раундапу окремо та у поєднанні, а також диклофенаку та ніфедипіну викликає пригнічення активності супероксиддисмутази (СОД), (за виключенням дії суміші при підвищеній температурі, яка активує СОД), зростання вмісту окисненого глутатоіну (GSSG), а в суміші – і відновленого глутатіону (GSH), що проявляється як зниження редокс-індексу GSH у всіх групах (максимально на 26%) крім групи МіxТ. У всіх групах цієї серії зростає утворення продуктів перекисного окиснення ліпідів (ТБК-АП) та окисних модифікацій протеїнів (ОМП). Концентрація 40 нМ Раундапу навпаки, активує СОД та загальну антиоксидантну активність, не змінює порівняно з контролем вміст та редокс індекс GSH, а у поєднанні з хлорпромазином чи підвищеною температурою викликає посилення загальної антиоксидантної активності, вмісту та редокс–індексу GSH. Разом з тим, у всіх дослідних групах зростає утворення ТБК-АП (на 7,0-16,3%) та окисних модифікацій протеїнів (на 13,2- 32,5%) (крім Rn-групи) порівняно з контролем. Вплив хлорпромазину вирізняється пригніченням каталазної активності. Відтак, Раундап, залежно від концентрації та поєднання з іншими факторами середовища, проявляє прооксидантний (80 нМ) або антиоксидантний (40 нМ) вплив, причому прооксидантний ефект посилюється у комбінованих експозиціях, особливо за підвищеної температури, та нівелює специфічний вплив фармацевтичних препаратів на цинк-залежні характеристики. Обчислення інтегральних індексів (Антиоксидантно-прооксидантний баланс (АПБ) та Інтегральний індекс біомаркерних реакцій (IBR)) засвідчило, що стан системи антиоксидатного захисту визначається переважно реакцією низькомолекулярних тіолів. У дослідних групах встановлено зміни активності центрального виконавчого ензиму апоптозу каспази-3. Вона зростає за впливу 40 нМ Раундапу окремо та у суміші з хлорпромазином, а також за дії ніфедипіну та поєднаної дії фармацевтичних препаратів та 80 нМ Раундапу, особливо за теплової дії (на 230%). Відтак, у більшості експериментальних груп виявляється взаємозв’язок між зменшенням вмісту лабільного цинку або збільшенням вмісту цинк-МТ та активацією каспази-3, що узгоджується з уявленнями про лімітуючу роль лабільного цинку як інгібітора каспази-3. Раундап (80 нМ) та ніфедипін пригнічували активність лізосомальної протеази катепсину Д, а диклофенак та комбінація чинників викликали збільшення його лізосомальної активності на 53 – 57 %. За впливу суміші та теплового чинника одночасно посислюються активності каспази-3 та екстралізосомального катепсину Д. Відтак, комбінована дія ксенобіотиків та підвищеної температури викликають потужну активацію цитозольних процесів апоптозу та/або аутофагії. Встановлено ознаку цитотоксичності як зменшення стабільності лізосомальних мембран за дії 40 нМ Раундапу у поєднанні з тепловим впливом та, особливо, 80 нМ Раундапу (зменшення у 1,6 разів), тоді як хлорпромазин та, особливо, ніфедипін окремо та у поєднаннях викликали стабілізацію лізосом (у 1,9-2,7 разів). Такий ефект ніфедипіну відповідає його ефектам на моделях хребетних тварин. Для з’ясування механізму деметалюючого впливу Раундапу на МТ молюска, ми здійснили експеримент ex vivo, у якому порівняли вплив Раундапу та хелатора цинку ТПЕНу у суміші з іонами цинку за інкубації тканини у експериментальному середовищі. Результати цього експерименту переконливо довели, що раундап не має прямого впливу на акумуляцію цинку у МТ, на відміну від ТПЕНу. Лише ТПЕН поокремо та за спільної з цинком дії викликав протилежні до дії цинку ефекти, зменшуючи рівень MTSH, збільшуючи каспазну-3 активність та лізосомальну стабільність. З іншого боку, Раундап мав прооксидантний та цитотоксичний ефект, знижуючи рівень GSH та лізосомну стабільність. Спільним проявом для всіх експериментальних груп у цьому експерименті було зниження у 2-8 разів співвідношення GSH/GSSG. Проведене нами дослідження ex vivo вперше засвідчило успішність використання хелатора цинку ТПЕНу для з’ясування цинк-залежних біохімічних реакцій у двостулкових молюсків. Відтак, у дисертаційній роботі встановлено особливості фунціонального стану МТ двостулкових молюсків U. tumidus за впливу Раундапу у низьких екологічно реальних концентраціях. Доведено, що дестабілізуюча дія Раундапу на цинк-залежні функції реалізується опосередковано через його прооксидантний вплив та ураження лізосомальних мембран. Інтегральний аналіз довів, що серед досліджуваних ефектів Раундапу, його вплив на клітинні низькомолекулярні тіоли МТ та GSH/GSSG був найбільш вираженим та послідовним, що робить ці показники перспективним біомаркерами токсичного впливу Раундапу. Відзначено, що фармацевтичні препарати диклофенак, ніфедипін та хлорпромазин, у екологічно реальних концентраціях спричинюють низку специфічних реакцій МТ, системи антиоксидантного захисту, ензимів апоптозу та функціонального стану лізосом. Проте більшість цих реакцій, за виключенням стабілізації лізосом, нівелюється за спільного впливу з Раундапом. Отримані результати вивчення комбінованого субхронічного (in vivo) та безпосереднього (ex vivo) впливу Раундапу та фармацевтичних препаратів у поєднанні з тепловим впливом на молюска U. tumidus свідчать про перспективність запропонованих дослідних схем для оцінки екологічно реального впливу забруднювачів водного середовища на біоту. Ключові слова: двостулкові молюски, металотіонеїни, цинк, глутатіон, антиоксидантна система, Раундап, диклофенак, ніфедипін, температурний вплив, хлорпромазин, ТПЕН, ex vivo.